Effects of epimedium on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.026

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Epimedium has been used in the treatment of osteoporosis and repair of bone defects.

OBJECTIVE: To explore the effects of epimedium on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: A database search was performed to retrieve literatures addressing epimedium effects on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Then, the papers meeting the criteria were selected for in-depth analysis. During the osteogenic differentiation induced by epimedium, alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin, transforming growth factor β, bone morphogenetic proteins, osteocalcin, bone sialoprotein were detected in the bone marrow mesenchymal stem cells to understand the underlying mechanism of epimedium in proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Epimedium effects on bone marrow mesenchymal stem cells are shown in a dose-dependent manner. During the early induction, icariin can increase cell phosphatase activity; in the late induction, icariin can increase calcified nodules, promote osteocalcin secretion, significantly improve the expressions of transforming growth factor β1, bone morphogenetic protein 2, insulin-like growth factor-1, osteopontin and bone sialoprotein. Epimedium, which can be used as an excellent osteoinductive factor, improves the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, myeloid progenitor cells, mesenchymal stem cell transplantation, drugs, Chinese herbal, medicine, Chinese traditional

CLC Number:

R318

Li Hui-zhen, Li Meng, Li Rui-yu, Wu Li-ping. Effects of epimedium on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 979-984.

Figures/Tables 3

成骨细胞鉴定指标包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形成蛋白、骨钙素、骨涎蛋白等，通过检测淫羊藿诱导骨髓间充质干细胞成骨性分化的细胞因子，分析淫羊藿对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响。 2.1 碱性磷酸酶和骨钙素碱性磷酸酶为一种同源二聚体的糖蛋白，是参与骨代谢的重要蛋白，被认为是细胞外基质成熟的早期标志[27]。碱性磷酸酶的活性可以代表成骨细胞早期的分化水平，随着成骨细胞分化的发展碱性磷酸酶表达会逐渐增强。目前，认为骨性碱性磷酸酶在体外钙化中起着关键性作用，主要机制在于碱性磷酸酶可分解有机磷酸酯释放无机磷，增加局部无机磷酸的浓度，为羟基磷灰石的沉积提供必须的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，促进矿化，所以碱性磷酸酶活性升高可以为细胞间质含量改变做好准备，并且是启动矿化的必备条件[28]。碱性磷酸酶活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志[29]。骨钙素是骨基质中重要的非胶原蛋白成分，由49个氨基酸构成。仅有成骨细胞能够合成和分泌骨钙素，主要出现在矿化形成期，因此，骨钙素是成骨细胞成熟的标志，也是成骨细胞功能的特异性标志，在骨细胞的形成过程中具有重要作用[30]。有学者研究认为骨钙素可能是骨的矿化以及骨吸收的关键因子，因为骨钙素能够促使成骨细胞的募集，增强破骨细胞的骨吸收能力[31]。Stein等[32]认为骨钙素可能是骨形成和骨吸收的耦合因子。碱性磷酸酶和骨钙素的表达程度都可以反映骨代谢的进程，而且骨钙素是比碱性磷酸酶更敏感、更特异的反映骨代谢的检测指标，能够反映瞬间的骨转换水平，在评价骨代谢进程方面具有重要意义。马莉萍[12]研究淫羊藿苷促进大鼠骨髓基质干细胞成骨性分化的作用与机制，取3月龄SD大鼠骨髓分离骨髓基质干细胞，原代培养第1次换液后分组并加入10，1， 0 μmol/L的淫羊藿苷。从培养第9天起用10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 mmol/L抗坏血酸磷酸诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。采用MTT法及流式细胞术分析淫羊藿苷对大鼠骨髓基质干细胞增殖的影响；采用偶氮偶合法进行碱性磷酸酶阳性克隆组织化学染色；采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性；采用免疫放射法测定培养液中骨钙素水平；von Kossa染色测定钙化结节数目；采用反转录-聚合酶链反应及实时定量聚合酶链反应检测淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞与成骨相关的7种基因表达的影响。研究发现淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的影响呈剂量依赖性，其中以浓度为10 μmol/L时作用最强，10 μmol/L淫羊藿苷抑制骨髓间充质干细胞的增殖，但在培养的各时期均显著促进其成骨性分化。其表现在诱导培养的早期提高细胞的磷酸酶活性，增加碱性磷酸酶阳性克隆数，在诱导培养的晚期增加细胞钙化结节数，促进骨钙素分泌量和细胞外基质中钙盐沉积量，在骨髓间充质干细胞诱导培养的第8，12天均显著提高磷酸酶活性、骨钙素、转化生长因子β1、骨形成蛋白2、胰岛样生长因子1、骨桥蛋白和骨涎蛋白等成骨相关基因mRNA的表达水平。由此可见，淫羊藿苷是中草药淫羊藿抗骨质疏松的主要有效成分，促进骨髓间充质干细胞骨形成分化的机制是提高细胞内磷酸酶活性，增加碱性磷酸酶阳性克隆、钙化结节数量，提高成骨相关基因mRNA的表达。 2.2 转化生长因子β和骨形态发生蛋白转化生长因子β家族是成骨细胞分化的基本调节因子，也是骨基质中含量丰富的细胞因子，可以通过多种效应途径实现调节功能，使成骨细胞和破骨细胞介导的骨形成和骨吸收处于平衡，并且提高成骨细胞特异性基因的表达，促进细胞外基质的合成，控制成骨细胞分化。骨形态发生蛋白是一种存在于骨基质中的糖蛋白多肽，骨形态发生蛋白的结构与转化因子在C端都含有7个高度保守的半胱氨酸残基，因此与转化因子同属于转化生长因子β超家族。骨形态发生蛋白可以促进骨形成，是骨髓间充质干细胞和成骨细胞分泌，并以非活性形式贮存在骨组织中[33]。骨形态发生蛋白在生物体内的一项重要生物学作用是可以诱导未分化的间充质细胞分化成为软骨细胞和骨细胞，而且也是惟一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。骨形态发生蛋白具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，还具有使成骨细胞的前体细胞定向分化为成骨细胞的能力。杨丽等[13]研究淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响，运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，以20 mg/L淫羊藿苷作为骨髓间充质干细胞药物干预浓度，根据干预条件的不同将实验分为空白组、经典组(加经典成骨诱导剂)、淫羊藿苷组、淫羊藿苷+经典组，通过ELISA法检测各组转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达，结果见表1。"

References

[1] 黄建华,沈自尹,吴斌,等.从基因表达谱和代谢组学角度探讨淫羊藿总黄酮延缓衰老的效应及机制[J].中国中西医结合杂志,2008, 28(1):47-50.

[2] 马慧萍,贾正平,白孟海,等.淫羊藿总黄酮对大鼠实验性骨质疏松生化学指标的影响[J].中国药理学通报,2003,19(2):187-190.

[3] Qin L, Han T, Zhang Q, et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol.2008;118(2):271-279.

[4] Zhang G, Qin L, Sheng H, et al. Epimedium-derived phytoestrogen exert beneficial effect on preventing steroid-associated osteonecrosis in rabbits with inhibition of both thrombosis and lipid-deposition. Bone.2007;40(3): 685-692.

[5] Ye HY, Lou YJ. Estrogenic effects of two derivative of icariin on human breast cancer MCF-7 cells. Phytomedicine.2005; 12(10):735-741.

[6] 唐孝明,裴福兴,沈彬,等.雌激素对脂多糖诱导成骨细胞凋亡基因表达影响的实验研究[J].中国骨质疏松杂志,2006,12(1):25-28.

[7] Sarraf CE, Otto WR, Eastwood M.In vitro mesenchymal stem cell differentiation after mechanical stimulation.Cell Prolif. 2011; 44(1):99-108.

[8] 肖军,马德彰,杨钟华,等.淫羊藿苷促进人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究[J].中华实验外科杂志,2013,30(7):1357-1359.

[9] 万方数据库.万方医学网[DB/OL].2013-11-21. https://med.wanfangdata.com.cn

[10] CNKI.中国知网[DB/OL].2013-11-21.https://www.cnki.net

[11] Medline.Pubmed[DB/OL].2013-11-21.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

[12] 马莉萍.淫羊藿苷促进大鼠骨髓基质干细胞成骨性分化的作用与机理研究[D].兰州:兰州大学,2007:1-37.

[13] 杨丽,张荣华,朱晓峰,等.淫羊藿苷对大鼠间充质干细胞骨向分化过程中转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(19):3518-3522.

[14] 吴昊,查振刚,姚平,等.淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2010,30(4):410-415.

[15] 杨月琴,王松,沈霖,等.淫羊藿对骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化以及FN表达的影响[J].中西医结合研究,2009,1(3): 121-125.

[16] 邱峰,陈英杰,鹿野美弘,等.淫羊藿苷在大鼠体内的代谢[J].药学学报,1999,34(3):222-226.

[17] Xu W, Zhang Y, Yang M, et al.LC-MS/MS method for the simultaneous determination of icariin and its major metabolites in rat plasma.J Pharm Biomed Anal.2007; 45(4): 667-672.

[18] 翟远坤,陈克明,葛宝丰,等.淫羊藿次苷Ⅱ通过激活雌激素信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化[J].中国药理学通报, 2011,27(10):1451-1457.

[19] 吴涛,徐俊昌,南开辉,等.淫羊藿苷促进羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(19): 3725-3729.

[20] 蒋绍艳,宋丹妮,史玉朋,等.淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J].海南医学院学报,2009,15(10):1198- 1200.

[21] 明磊国,王鸣刚,陈克明,等.淫羊藿苷对体外培养成人骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响[J].中国骨质疏松杂志,2010, 16(2): 100-104.

[22] 陈克明,葛宝丰,马慧萍,等.淫羊藿苷对体外培养骨髓基质干细胞成骨性分化的影响[J].中国骨质疏松杂志,2008,14(9):642-646.

[23] 毛项颖,卞琴,沈自尹.淫羊藿苷介导MAPK信号通路促进间充质干细胞株C3H10T1/2成骨分化的体外研究[J].中西医结合学报, 2012,10(11):1272-1278.

[24] 仇志强.淫羊藿苷在骨坏死微环境中对狗骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化影响的初步研究[D].江西:南昌大学,2012:1-16.

[25] 许应星,许兵,吴岩,等.淫羊藿总黄酮对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中DKK1蛋白动态表达的影响[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2010,3(4):276-284.

[26] 马慧萍,贾正平,张汝学,等.淫羊藿总黄酮含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化[J].中国骨质疏松杂志,2004,10(4): 420-423.

[27] Bruder SP, Jaiswal N, Ricalton NS, et al.Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration.Clin Orthop Relat Res.1998;(355 Suppl):S247-256.

[28] Sierra RI, Specker BL, Jiménez F, et al.Biochemical bone markers, bone mineral content, and bone mineral density in rats with experimental nephrotic syndrome.Ren Fail.1997; 19(3):409-424.

[29] Abdallah BM, Jensen CH, Gutierrez G, et al.Regulation of human skeletal stem cells differentiation by Dlk1/Pref-1.J Bone Miner Res.2004;19(5):841-852.

[30] Cosman F, Shen V, Morgan D, et al.Biochemical responses of bone metabolism to 1,25-dihydroxyvitamin D administration in black and white women.Osteoporos Int.2000;11(3):271-277.

[31] Spector JA, Greenwald JA, Warren SM, et al.Dura mater biology: autocrine and paracrine effects of fibroblast growth factor 2.Plast Reconstr Surg.2002;109(2):645-654.

[32] Stein GS, Lian JB, Dworetzky SI, et al.Regulation of transcription-factor activity during growth and differentiation: involvement of the nuclear matrix in concentration and localization of promoter binding proteins.J Cell Biochem.1991; 47(4): 300-305.

[33] Nishimura T, Simmons DJ, Mainous EG.The origin of bone formed by heterotopic periosteal autografts.J Oral Maxillofac Surg.1997;55(11):1265-1268.

[34] Chen J, Shapiro HS, Sodek J.Development expression of bone sialoprotein mRNA in rat mineralized connective tissues.J Bone Miner Res.1992;7(8):987-997.

[35] Chen J, McKee MD, Nanci A, et al.Bone sialoprotein mRNA expression and ultrastructural localization in fetal porcine calvarial bone: comparisons with osteopontin.Histochem J. 1994;26(1):67-78.

[36] Wuttke M, Müller S, Nitsche DP, et al.Structural characterization of human recombinant and bone-derived bone sialoprotein. Functional implications for cell attachment and hydroxyapatite binding.J Biol Chem. 2001;276(39): 36839-36848.

[37] Cho P, Schneider GB, Krizan K, et al.Examination of the bone-implant interface in experimentally induced osteoporotic bone.Implant Dent.2004;13(1):79-87.

[38] Ross FP, Chappel J, Alvarez JI, et al.Interactions between the bone matrix proteins osteopontin and bone sialoprotein and the osteoclast integrin alpha v beta 3 potentiate bone resorption. J Biol Chem.1993;268(13):9901-9907.